Навигация по сайтуНавигация по сайту

Диагностика наследственных заболеваний

Диагностика наследственных заболеваний: традиционная

Традиционная диагностика наследственных и инфекционных заболеваний строится на изучении симптомов и проведении биохимических анализов, включая культивирование патогенных микроорганизмов на питательных средах. При этом выявление бессимптомного носительства вредных аллелей и микроорганизмов- возбудителей превращается в чрезвычайно трудоемкую задачу. Традиционными цитогенетическими методами можно выявить в геноме человека лишь некоторые крупные хромосомные перестройки: протяженные и генетического материала, потерю или приобретение целых хромосом. При этом мелкие делеции, транслокации и вставки, а также , остаются не обнаруженными.

То же имеет место и при диагностике бессимптомного носительства возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы, например, , которые в латентной стадии инфекции могут присутствовать в организме человека лишь в небольшом числе копий.

Методы молекулярной биологии, и особенно , значительно облегчили проведение диагностики наследственных и инфекционных заболеваний. При этом мутации выявляются в ДНК клинических образцов, а бессимптомное присутствие возбудителей обнаруживают по наличию геномных ДНК или РНК соответствующих вирусов или бактерий.

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ: ДИАГНОСТИКА: ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Показания для проведения цитогенетических исследований

Показания для цитогенетического исследования достаточно широкие, особенно при акушерско-гинекологической и детской патологии. Ниже приводиться перечень (возможно, неполный) состояний, при которых с диагностическими целями надо иметь результаты цитоге-нетического исследования, проведенного у пациента (пробанда) и при случае необходимости у его родственников.

1. Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза).

2. Наличие у ребенка множественных врожденных пороков развития, не относящихся к генному синдрому.

3. Многократные (более двух) спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с врожденными пороками развития.

4. Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

5. Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка.

6. Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребенка с хромосомной болезнью.

7. Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью (учет и ).

8. Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффект-ивности лечения и прогноза течения).

9. Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических).

Медицинских ограничений для применения цитогенетических методов нет. Однако необходимо помнить, что эти методы трудоемкие, дорогие, назначение их наугад не оправдано. Правильнее назначать цитогенетическое исследование по рекомендации врача-генетика после проведения медико-генетического консультирования.

Опыт работы зарубежных медицинских учереждений показал необходимость создания цитогенетических лабораторий при больших многопрофильных больницах и медико-генетических консультациях, комплексно обслуживающих какой-либо район или город. В России цитогенетические исследования проводятся в медико-генетических кабинетах и медико-генетических консультациях.

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ: ДИАГНОСТИКА: БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Наследственные болезни: диагностика: биохимические методы: введение

Биохимические методы в лабораторной диагностики наследственных болезней применяются с начала хх в. Биохимические показатели (первичный, белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях больного) отражают сущность болезни более адекватно, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте. Значимость биохимических методов повышалась по мере описания наследственных болезней и совершенствования этих методов (электрофорез, хроматография, спектроскопия и др.).

Биохимические методы направлены на выявления биохимического фенотипа организма. Уровни, на которых оценивается фенотип, могут быть разными: от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в моче или поте. Поэтому биохимические методы чрезвычайно многообразны и их значение в диагностике наследственных болезней постоянно возрастает.

Разработка молекулярно-генетических методов диагностики наследственных болезней частично отодвинула интерес к биохимическим исследованиям, но вскоре стало ясно, что в большинстве случаях указанные методы дополняют друг друга, поскольку молекулярно-генетически описывается , а биохимически . А болезнь - это в конечном счете фенотип. Именно поэтому, несмотря на сложность, а иногда и на дороговизну биохимических методов, им принадлежит ведущая роль в диагностике моногенных наследственныхболезней. Современные высокоточные технологии (жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, магнитная резонансная спектроскопия, бомбардировка быстрыми нейтронами) позволяют индентифицировать любые метаболиты, специфические для конкретной наследственной болезни.

На первый взгляд, может показаться, что самым точным методом диагностики является определение мутации на уровне ДНК. Однако это не всегда так. Реализация действия гена - сложный процесс, поэтому наличие нормальной структуры гена, а точнее, необнаружение мутации, не всегда является гарантией нормального биохимического фенотипа.

Принципы биохимической диагностики наследственных болезней менялись в процессе развития генетики человека и биохимии. Так, до 50-х годов диагностика была направлена на поиски специфических для каждой болезни метаболитов в моче ( , ).

С 50-х до 70-х годов упор в диагностике был сделан на выявление энззимопатий. Разумеется, поиски метаболитов в конечных реакциях при этом не исключались. Наконец, с 70-х годов главным объектом при диагностике стали белки разных групп. К настоящему времени все эти объекты являются предметом биохимической диагностики.

Наследственные болезни: система использования биохимических методов

В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, в использовании этих методов должна быть определенная система. У обследуемого пробанда или члена его семьи нереально исключить все наследственные болезни, которые могут быть в поле зрения при обследовании. Если применять возможное число методов диагностики, то тогда каждое обследование станет очень трудоемким и долгим. Вот почему исходная схема обследования строиться на клинической картине болезни, генеалогических сведениях и биохимической стратегии, которые позволяют определить дальнейший ход обследования на основе поэтапного исключения определенных классов болезней.

Наследственные болезни: объекты биохимической диагностики

Необходимо подчеркнуть, что биохимические методы (в отличии от цитогенических) многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Объектами биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибропласты, лимфоциты). При использовании в биохимической диагностике можно выделить два уровня: первичный и уточняющий#. Каждый из этих уровней может быть разнообразно нагружен реакциями в зависимости от возможности лаборатарии.

Наследственные болезни: программы первичной биохимической диагностики

Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы выявить здоровых индивидов и отобрать индивидов для последующего уточнения диагноза. В таких программах первичной диагностики в качестве объектов используется моча и небольшое количество крови. Программы первичной биохимической диагностики наследственных болезней могут быть массовыми и селективными. в диагностике фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, адреногенитального синдрома, врожденных аномалий развития нервной трубки и болезни Дауна описаны в .

Наследственные болезни: селективные диагностические программы

Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов, у которых подозреваются генные наследственные болезни. Фактически такие программы должны функционировать в каждой большой больнице. Показания для их применения достаточно широкие, стоимость каждого анализа невысокая.

В селективных программах могут использоваться простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии или с динитрофенилгидразином для выявления кето-кислот) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. Например, с помощью тонкослойной хроматографии мочи и крови можно диагностировать наследственные нарушения обмена аминокислот, олигосахаридов и гликозамингликанов (мукополисахаридов). Газовая хроматография применяется для выявления наследственных болезней обмена органических кислот. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируется вся группа гемоглобинопатий.

Нередко приходиться углублять биохимический анализ - от количевственного определения метаболита до определения активности фермента (использование нативных тканей или культивированных клеток), например, с помощью флюорометрических методик.

Наследственные болезни: показания для биохимического обследования

Показаниями для применения биохимических методов диагностики у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное равновесие, остановка роста. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо наследственной болезни клиническая картина).

Биохимические методы применяются для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность ?1-антитрипсина, недостаточность Г-6-ФД и т.д.). Следует отметить, что для диагностики многих болезней биохимические методы заменяются молекулярно-генетическими либо в связи с большой точностью последних, либо с их экономичность.

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ: ДИАГНОСТИКА: МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Наследственные болезни: диагностика: молекулярные методы: общие процедуры

Молекулярно-генетические методы - это большая и разнообразная группа методов, в конечном счете предназначенном для для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК (аллеля, гена, региона хромосомы) вплоть до расшифровки последовательности оснований. В основе этих методов лежат манипуляции с ДНК и РНК. В результате бурного развития молекулярной генетики человека в 70-80-х годах и последуещего успешного изучения генома человека молекулярно-генетические методы широко вошли в медики-генетическую практику.

Чтобы познакомиться с сутью и терминалогией молекулярно-генетических методов, ниже будут схематично описаны их основные этапы и варианты. Освоение же этих методов, как и других методов лабораторной диагностики, требует специальной подготовки в соответствующих лабораториях.

1. Получение образцов ДНК (или РНК) является исходным этапом всех методов. Этот этап реализуется в двух вариантах:

а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток;

б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.

Источником геномной ДНК могут быть дюбые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма. Поэтому такие образцы называются геномной ДНК. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа необходимо иметь (в зависимости от используемого метода) от нескольких нанограммов до нескольких микрограммов ДНК. Для этого требуется действительно небольшое количество биологического материала: например, 20-40 мг хориона, 1 мл крови, 5-10 мг культуры клеток. Для осущевствления некоторых методов достаточно 1 каплю крови или соскоб эпителия со щеки, или несколько волосяных луковиц. Возможность проведения молекулярно- генетического анализа с небольшим количеством легкодоступного биологического материала является методическим преимуществом методов названной группы. К этому еще можно добавить, что выделенная ДНК одинаково пригодна для проведения различнных вариантов методов и может долго сохраняться в замороженном виде.

Революцией в диагностике явилась разработка метода

2. Рестрикция ДНК на фрагменты является необходимым этапом в молекулярно-генетической диагностике. Этот процесс осуществляется #рестриктазами#, относящимся к группе бактериальных эндонуклеаз. В генетике человека используется несколько десятков разных рестриктаз. Основное их свойство - разрывать двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований (редко больше). При обработке геномной ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.

3. обеспечивает разделение этих фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле). После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно опрелелить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

4. Визуализация

Наследственные болезни: молекулярные диагностические приемы

Наследственные болезни: методы прямой диагностики мутаций

Прямая диагностика мутаций включает несколько методов: определение нуклеотидной последовательности (секвенирование); выявление нарушения места рестрикции; аллльспецифическую гибридизацию с синтетическими олигонуклеотидными зондами; химическое и ферментативное расщепление ДНК в местах неправильного сшивания оснований; регистрацию изменения электрофоретической подвижности мутантных молекул ДНК; трансляцию белкового продукта in vitro. Метод нуклеотидной последовательности. Непосредственная диагностика патологических мутаций путем определения нуклеотидной последовательности является наиболее точным. Она позволяет достоверно выявлять замены оснований, делеции и вставки на всем протяжении изучаемого фрагмента. поскольку трудоемкость секвенирования еще большая, стоимость высокая, то эти обстоятельства частично ограничивают применение этого варианта прямой детекции мутаций. Однако развитие автоматизации секвенирования позволяет надеяться, что в будущем этот метод займет ведущее место.

Наследственные болезни: метод выявления мутаций по нарушению рестрикции

Выявление нарушения места рестрикции осуществляется с помощью . При обработке соответствующей рестриктазой в геле отсутствуют фрагмент ДНК, выявляемый у нормальных индивидов. Примерно 50% нуклеотидных замен приводит к изменению места (или сайта) рестрикции, благодаря чему возможна прямая детекция мутаций на основе рестриктного анализа.

Наследственные болезни: метод выявления мутаций гибридизацией с зондом

Аллельспецифическая гибридизация с позволяет обнаруживать мутации в геномной ДНК. Последовательность оснований в олигонуклеотидном зонде может быть задана по нормальному или патологическому варианту гена, затем помечена. И в том, и в другом случае такой зонд используется для гибридизации с фрагментов ДНК обследуемого индивида.

Наследственные болезни: метод выявления мутаций по расщеплению ДНК

Химическое (или ферментативное) расщепление ДНК в местах неправильной сшивки оснований выявляет большую группу мутаций, ведущих к нестабильности ДНК. Мутации в молекуле ДНК могут изменять электрофоретическую подвижность фрагмента ДНК.

Во-первых, могут изменяться температурные показатели плавления двухцепочечных фрагментов, что можноопределить с помощью электрофореза двухчепочечной ДНК в градиентном денатурирующем геле (так называемый денатурирующий гель-электрофорез).

Во-вторых, в результате мутации изменяться конформация одночепочечных фрагментов, что выявляется путем электрофореза предварительно денатурирующих ДНК в неденатурирующих условиях. В-третьих, проводиться так называемый гетеродуплексный анализ, с помощью которого обнаруживаются нарушения линейности гетеродуплексов в местах коротких вставок и делеций. Суть этого варианта электрофорез двухчепочечной ДНК в нейтральном или равномерно денатурирующем геле

Наследственные болезни: метод выявления мутаций по трансляции белков

Трансляция белкового продукта осуществляется в системе in vitro на основе полученной специфической мРНК с добавлением лизата ретикулоцитов (в нем содержатся все необходимые компоненты для синтеза белка). В этой системе синтезируется белковый продукт соответствующего гена. Продукт трансляции анализируют с помощью электрофореза. Изменение электрофоретической подвижности белка свидетельствует о наличии мутации (нонсенс-мутация, нарушение сплайсинга РНК, сдвиг рамки считывания).

Наследственные болезни: косвенные методы выявления мутаций

Косвенное выявление мутаций применяется в тех случаях, когда нуклеотидная последовательность гена еще неизвестна и вместе с тем имеется информация об относительном положении ге на на генетической карте. Фактически это соответствует диагностике с помощью метода сцепления генов. Технические приемы в косвенной диагностике те же самые, что и в прямой диагностике (получение ДНК, рестрикция, электрофорез и т.д.). Естественно, к этому добавляется математический анализ сцепления признаков.

Основной недостаток косвенных методов диагностики:

Основной недостаток косвенных методов диагностики - обязательное предварительное изучение генотипа (гаплотипа) хотя бы одного пораженного родственника. В случае отсутствия пораженных родственников, доступных для обследования, проведение диагностики (за редким исключением) становиться невозможным.

Полиформизм длин рестриктных фрагментов (ПДРФ) для выявления мутаций

Использование косвенных подходов оказалось возможным благодаря существованию в геноме полиморфных локусов ДНК. Нуклеотидные замены достаточно часто встречаются в некодирующих участках ДНК. Значительное число нуклеотидных замен приводит к изменению картины рестрикции. Эти изменения можно выявить с помощью блотгибридизации по Саузерну, поскольку изменяется длина рестриктных фрагментов. Эта разновидность полиморфизма ДНК получила название полиформизма по длине рестриктных фрагментов (ПДРФ).

Расположенный вблизи изучаемого гена или внутри него полиморфный сайт может служить маркером аллельных вариантов этого гена, в том числе маркером патологических мутаций.

Маркеры микросателлитные

Часто используемыми в диагностике типами полиморфизма ДНК являются короткие повторяющиеся последовательности, или . Это моно-, ди-, три- и тетрануклеотидные тандемно повторяющиеся последовательности ДНК.Микросателлитные локусы с большой частотой встречаются в геноме и достаточно равномерно распределены по длине генома. В основе полиморфизма микросателлитов лежат различия в числе повторяющихся единиц. Использование микросателлитов в качестве маркерных локусов позволяет в большинстве случаев легко проследить в родословной передачу мутантного гена. ( )

Микросателлитные локусы анализируют с помощью PCR реакции. Этот подход был предложен J.L. Weber с соавт. в 1989 г. [ ]. Он основан на использовании диспергированных повторов (dC-dA)n((dG-dT)n, которые являются одним из наиболее распространенных семейств повторов в человеческой ДНК. Авторы показали, что блоки (dC-dA)n((dG-dT)n полиморфны по длине среди разных индивидуумов, что позволяет использовать их в качестве генетических маркеров. Так, например, проведенное ими сравнение описанных в литературе (dC-dA)n((dG- dT)n последовательностей, которые были клонированы 2 или более раз, показало, что в 7 случаях из 8 их длины различны. Но, что не менее важно, авторы предложили эффективный метод анализа этих маркеров - их амплификацию с помощью PCR с последующим разделением продуктов реакции на полиакриламидном геле, что позволило резко повысить чувствительность и скорость анализа по сравнению с традиционными методами, основанными на гибридизации геномных блотов.

Впоследствии были разработаны чрезвычайно эффективные методы анализа микросателлитов. Diehl с соавт. [ ] предложили использовать праймеры, меченые флуоресцентной краской, для PCR анализа динуклеотидных повторов с последующей детекцией продуктов реакции с помощью автоматического лазерного детектора фрагментов ДНК.

Ziegle с соавт. [ ] разработали автоматизированный метод анализа тандемных повторов с помощью стандартных автоматических секвенаторов ДНК. Они предложили метить праймеры 3 различными флуоресцентными красителями, что упозволяет анализировать сразу 3 образца в одной дорожке (четвертый краситель используется для мечения стандарта молекулярного веса, который наносится в ту же дорожку). Это позволило резко поднять производительность такого метода и повысить точность определения длин фрагментов (до (0,05 п.о.).

Эффективные методы анализа позволили широко использовать этот тип маркеров в различных проектах картирования.

Так, например, использование коротких тандемных повторов позволило обнаружить локусы, ответственные за ряд широко распространенных многофакторных заболеваний в модельных организмах (таких как локусы, связанные с с [ ], генов, связанных с и [ , ].

Использование микросателлитов в качестве маркерных локусов.

 

ДНК-ДИАГНОСТИКА НАСЛЕДСТВЕННЫХ И ПРИОБРЕТЕННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Соматические клетки организма-потомка, который развивается из мутантной зиготы, образовавшейся от слияния мутантных гамет, будут содержать эту мутацию. Чем позже в онтогенезе возникает соматическая мутация, тем меньше размер клона мутантных клеток во взрослом организме. Если мутация доминантна, то возникает наследственное заболевание. Если мутация рецессивна, можно говорить о предрасположенности организма- гетерозиготы к соответствующему заболеванию и носительстве мутантного гена.

Организм, у которого действие рецессивной мутации маскируется функционированием полноценного аллеля, фенотипически выглядит нормальным, однако имеет больше шансов дать больное потомство в браке с носителем такого же мутантного гена. Кроме того, может произойти соматическая мутация в соответствующем аллельном гене соматических клеток, что станет причиной развития приобретенного генетического заболевания. Примером таких заболеваний может служить .

НАСЛЕДСТВЕННЫЕ БОЛЕЗНИ: ДИАГНОСТИКА: ОБСЛЕДОВАНИЕ ПЛОДА

Наследственные болезни: обследование плода: неинвазивные методы

Речь идет о методах обследования плода без оперативного вмешательства. В настоящее время к ним относится фактически только . Радио - или рентгенография применялись 20-30 лет назад (да и то не очень широко) на начальных этапах .

Совершенствование инвазивных методов шло и продолжает идти в нескольких направлениях: более раннее получение образцов для исследования, более широкий спектр образцов, более безопасные для беременности и здоровья плода методы взятия образцов.

К настоящему времени в мировой практике имеется достаточный опыт (сотни тысяч обследованных) по применению следующих инвазивных методов:

Наследственные болезни: диагностика: биопсия хориона и плаценты

Биопсия применяются для получения небольших кусочков плаценты в период с 7-й по 16-ую неделю беременности. Первоначально этот метод развивался для использования в пренатальной диагностике в 1-м триместре беременности. Процедура осущевстляеся трансабдоминально или трансцервикально под контролем УЗИ. Принципиально разницы между показаниями для применения этих двух способов биопсии нет. Эффективность диагностики зависит от того,каким метдом специалист владеет лучше. Хотя по оперативной технике хорионбиопсия относится к простым операциям, необходимы достаточный опыт и постоянное его подкрепление. Хорошие результаты отмечаются у акушеров, делающих не менее 200-400 хорионбиопсий в год. Неудачи взятия образцов ткани хориона составляют 1- 4%. Общее количествло хорионбиопсий в мире к 1995 г. превышало 500000. На основе этого большого материала сделаны выводы об осложнениях после хорионобиопсии. После трансцерквиальной хорионбиопсии примерно у 10% женщин отмечается небольшое кровотечение, очень редко - маточная инфекция, после трансабдоминального способа сокращение мускулатуры матки отмечаются у 2,5 % женщин. Обучить трансцервикальному методу трудно, метод имеет больше противопоказаний, обусловленных клиническими условиями и анатомическими особенностями. Одним из осложнений хорионбиопсии является спонтанный аборт (выкидыш). Общие потери плода после хорионбиопсии состовляют в среднем 2.5-3%. Не вся эта потеря обусловлена самой процедурой: в эту величину входит и спонтанная частота выкидышей. Собственно хорионбиопсия индуцирует, очевидно, 1-2% случаев преждевременного прерывания беременностей.

Каких-либо нарушений плаценты, роста плода, появление врожденных пороков развития и увеличение перинатальной смертности после хорионбиопсии не наблюдается. В некоторых центрах отмечено, что ранняя хорионбиопсия (в срок до 8 нед. беременности) может индуцировать поперечные врожденные ампутации конечностей, так называемые редукционные пороки. В связи с этим (с 1992 г.) хорионбиопсию рекомендуется проводить после 8-й недели беременности, а после 11-й недели плацентобиопсию.

Образцы хориона (ворсины) подлежат лабораторной диагностике наследственных болезней. При аспирации ворсин хориона в материал могут попадать клетки слизистой оболочки матки, что может приводить к некоторым диагнстическим ошибкам. Считается, что в 4% случаев лабораторная диагностика биоптатов хориона дает ложноположительные результаты, а иногда хотя и редко ложноотрицательные.

Наследственные болезни: диагностика: амниоцентез

Амниоцентез, или прокол плодного пузыря, с целью получения околоплодной жидкости и находящихся в ней слущеных# клеток амниона и плода используется для пренатальной диагностики с начала 70-х годов. Уже накоплен опыт проведения этой процедуры. Диагностическая значимость метода не вызывает сомнений. Эта процедура осуществляется на 15-18-й неделе беременности. Риск осложнений при амниоцентезе меньше, чем при хорионбиопсии. По данным некоторых авторов, он совсем незначительный (0.2%). По этой причине во многих центрах пренатальной диагностики предпочитают делать амниоцентез, а не хорионбиопсию. В случае неудавшегося анализа хорионбиоптатов пренатальная диагностика повторяется с помощью амниоцентеза.

Амниоцентез делают чрезбрюшинно под контролем УЗИ, чтобы не повредить плаценту. Чрезвлагалищный амниоцентез возможен, но такой подход применяется редко. Предлагавшиеся ранее биохимическое и вирусологическое исследование амниотической жидкости малоинформативно для пренатальной диагностики. Из биохимических показателей жидкости только концентрация является диагностически значимой. Уровень АФП существенно повышается при аномалиях нервной трубки и дефектах передней брюшной стенки. Основным источником диагностического материала при амниоцентезе являются клетки. Их обязательно надо культивировать и для цитогенитических, и для биохимических исследований. Только молекулярно-генетические варианты не требуют культивирования клеток.

Наследственные болезни: диагностика: кордоцентез

Кордоцентез, т.е. взятие крови из пуповины, стал использоваться шире после того, как эту процедуру начали осуществлять под контролем УЗИ, т. е. без . Процедуру проводят в срок с 18-й по 22-ую неделю беременности. Образцы крови являются объектом для цитогенетических, молекулярно-генетических и биохимических методов диагностики наследственных болезней. Кордоцентез используют для диагностики хромосомных болезней, гематологических наследственных болезней, иммунодефмцитов, гематологического статуса при резус - сенсибилизации, внутриутробных инфекций. Обобщений по осложнениям кордоцентнза нет, Процедура с первой попытки успешна в 80-97% случаев. Преимущество кордоцентеза по сравнению с амниоцентезом заключается в том, что кровь является более удобным объектом для исследования, чем клетки амниотической жидкости. культивируются быстрее и надежнее, чем амниоциты.

Наследственные болезни: диагностика: биопсия тканей плода

Биопсия тканей плода как диагностическая процедура осуществляется во 2-м триместре беременности под контролем УЗИ. Для диагностики тяжелых наследственных болезней кожи делают биопсию кожи плода. Далее проводится патоморфологические исследования. Морфологические критерии наличия наследственных болезней кожи позволяют поставить точный диагноз или подтвердить его. Для диагностики на внутриутробной стадии развития разработан иммунофлюоресцентный метод. Для этого производят биопсию мышц плода. Биоптат обрабатывается моноклональными мечеными антителами к белку , который у больных не синтезируется. Соответствующая флюоресцентная обработка "высвечивает" белок. При унаследовании патолагического гена свечение отсутствует. Этот прием является примером диагностики наследственной болезни на уровне первичного продукта гена. В случае миопатии Дюшенна такой метод дает более правильные результаты, чем молекулярно - генетическая диагностика.

Наследственные болезни: диагностика: фетоскопия

Фетоскопия (введение зонда и осмотр плода) при современной гибко- оптической технике не представляет больших трудностей. Однако метод визуального обследования плода для выявления врожденных пороков развития используется редко - только при особых показаниях. Он применяется на 18-23 недели беременности. Дело в том, что почти все врожденные пороки развития, которые можно увидеть с помощью оптического зонда, диагностируются с помощью УЗИ. Понятно, что процедура УЗИ проще и безопаснее. Для фетоскопии требуется вхождение зонда в амниотическую полость, что может вызвать осложнение беременности. Выкидыши отмечаются в 7 - 8 % случаев фетоскопии.

Наследственные болезни: профилактика и пренатальная диагностика

и позволяют в суммированном виде представить весь объем и возможности первичной профилактики наследственных болезней путем элиминации эмбрионов и плодов после .

Врачу общей практики необходимо иметь представление о методах пренатальной диагностики, их возможностям и ограничениях, показаниях для направления на пренатальную диагностику,

Методы пренатальной диагностики постоянно совершенствуются как в способах взятия образцов клеток и тканей, так и в разработке лабораторных методов. Это означает, что в недалеком будущем почти каждой семье можно будет помочь в предупреждении рождения больного ребенка.

Метод (группы) Вид метода. Сроки проведения (недели беременности).

Просеивающие

Медико - генетическое До и во время беременности.

консультирование. Определение уровня АФП в

сыворотке крови беременной. 16-20-я

Хорионический гонадотропин. То же.

Неконъюгированный эстриол .

Ацетилхолинэстераза..

Неинвазивные.

Ультразвуковое исследование. 6-24-я.

Инвазивные

Хорионбиопсия. 9-11-я

Плацентобиопсия. 11-22-я

Амниоцентез. 15-17-я

Кордоцентез. 18-22-я

Биопсия кожи. 14-16-я

Биопсия мышц. 18-22-я

. Фетоскопия 18-22-я

Табл 10.3.

Показания для разных методов лечения наследственных болезней обнаруживаемых инвазивной пренатальной диагностикой.

Метод (материал).

Показания.

Цитогенетическкое исследование (клетки хориона, культивированные амниотические клетки или лимфоциты плода).

Возраст женщины к моменту родов 35 лет и более, наличие хромосомной мутации у одного из родителей,рождение предыдущего ребенка схромосомной болезнью,низкий уровень АФП в сыворотки крови беременной, результаты УЗИ, предпологающие хромосомную болезнь у плода.

Молекулярно-генетическое, биохимическое иммунологическое исследование хорион, амниотические клетки, кровь.

Высокий риск рождения ребенка с генной болезнью по медико - генетического консультирования ( ретро - или проспективного) или просеивающих программ выявления гетирозиготного носительства, диагностика инфекции плода, иммунодефицитов, иммунологической несовместимости матери и плода.

Патаморфологическое исследование (кожа и мышцы плода).

Высокий риск рождения ребенка с наследственным заболеванием кожи (изтиозы,эпирдермолизы), с мышечной дистрофией Дюшенна.

Фетоскопия.

Уточнение диагноза врожденных пороков развития.

 

Наследственные болезни: преимплатанционная диагностика

Успехи биологии и медицины обеспечили возможность нехирургического лаважа яйцеклеток человека, оплодотворения и развития зиготы до стадии бластоцисты в лабораторных условиях. Затем такой зародышевый пузырек имплантируется в матку. Там происходит его дальнейшее нормальное развитие. Этот метод широко используется в акушерской практике. Такое манипулирование с зародышевыми клетками и зародышем натолкнуло гинетиков на мысль об использовании зародыша на ранних стадиях развития для диагностики наследственных болезней. Это направление исследований было названо преимплантационная диагностика. Такая диагностика относится к методам первичной профилактикм наследственных болезней. Преимущество ее заключается в том, что она помогает избежать повторных абортов в семьях с высоким риском наследственной патологии, если будет проводится обычная пренатальная диагностика. Преимплантационная диагностика успешна при следующих условиях:

1) легкое получение зародыша на преимплантационной стадии развития

2) наличие диагностических микрометодов на уровне использования одной или нескольких клеток.

3)микрохирургическая техника для взятия минимального числа клеток без повреждения зародышевого пузырька.

4) точные медицинские показания со стороны семьи для проведения диагноза.

Получение преимплантационных эмбрионов возможно двумя путями: нехирургическим маточным лаважом и оплодотворением в пробирке. С помощью маточного лаважа можно получить еще не имплантировавшийся зародыш в период 90-130 ч. после оплодотворения. К этому времени зародыш спускается из маточной трубы в матку. Эта прцедура безболезненная и безопасная. После посадки зародыша в матку успешная беременность наступает в 50% случаев. и дробление зиготы хорошо апробированы в акушерской практике. Этот метод применяют в случаях преодоления бесплодия по причине непроходимости труб. Несмотря на то, что только 10-20% подсадок являются успешными, метод используется все шире. Микрохирургическая процедура осуществляется с помощью микроманипулятора. Из зародыша можно отделить 1-2 клетки на стадиях 8-16 клеток. Иногда исследования ограничиваются вторичным #полярным тельцем.# Зародыш сохраняют в условиях глубокой заморозки, пока проводится анализ клетки. Посадка во время заморозки может быть сделана во время любого другого овариального цикла, не обязательно в тот же месяц, когда взята яйцеклетка. Диагностика на уровне одной клетки (или нескольких) в настоящее время реальна при некоторых болезнях. Ее проводят с использованием #полимеразной# цепной реакции,# моноклональных антител#, ультрамикроаналитических методов. Уже появились сообщения об успешной диагностике на преимплантационной стадии развития пола плода, муковисцидоза. Можно надеяться, что в ближайшие годы методические возможности преимплантационной диагностики расширятся как в области получения диагностического материала, так и аналитических методов.

Опубликовано: 19.02.2008 в 01:50

Похожие статьи

Вперед Назад

Комментарии

Комментарии отсутствуют

Выберите себе хорошего специалиста!

Понравилось? Поделитесь с друзьями или разместите у себя: